ماستر (LMD)
French
2006
Contribution à l'étude de la polyphénol oxydase d'Agaricus bis porus. Conception d'un système à fibre optique pour le dosage des composés phénoliques en solution
BENIVL4NSOUR A. , GOUZI Hicham
كلية العلوم-جامعة أبو بكر بلقايد - تلمسان · الجزائر
IIRI&JM!Dans cette étude la polyphénol oxydase (PPO; EC : 1.14.18.1) a été, tout d'abord,- extraite en milieux aqueux à partir d'une poudre d'acétone de champignon de Paris(Agaricus bisporus). L'extrait brut d'enzyme est ensuite partiellement purifié par précipitationpar l'acétone suivie d'un fractionnement par le sulfate d'ammonium à 60%. Nous avons- observé que les différents extraits enzymatiques brut et partiellement purifiés possèdent deuxactivités catécholase et crésolase mesurées par spectrophotométrie à 420 et 475 Mn pour lepyrogallol et la L-tyrosine respectivement. En fin de purification, l'activité enzymatique est- doublée pour les deux activités. L'activité volumique déshydrogénase atteint 189,3 et 3,35U.E/ml pour l'activité hydroxylase (30°C, pH 7- tampon phosphate de sodium 0,1M). Lesextraits des enzymes stockés à -15°C pendant 44 jours sont relativement stables. On aconstaté l'existence d'une faible activité laccase qui représente seulement 0,22 % de l'activitétotal polyphénol oxydase.L'étude des effets du pH, la spécificité du substrat, la concentration du substrat etd'enzyme et la température, a été effectuée. Deux pH optimaux ont été trouvé pour lesdifférents extraits d'enzymes, l'un est de 5,3 et l'autre est de 7 ou 7,6 avec le pyrogallolcomme substrat utilisant soit l'extrait brut et partiellement purifié par le sulfate d'ammoniumsoit par précipitation par l'acétone. Il est remarquable que l'activité enzymatique soitmaximale au voisinage de la neutralité. Il s'est avéré aussi que le pH optimal de l'enzymedépend du degré de pureté de l'enzyme et du substrat phénolique. La PPO peut catalyser lesmono-, di- et les triphénols avec une préférence variable. En terme d'efficacité catalytique(Vtiax/Km), le catéchol représente le meilleur substrat pour l'enzyme. Les paramètrescinétiques de l'enzyme d'extrait brut sont: V n ax = 78,6 (U.E/min.mI), Km = 1,4 mM et K =249,82 mM pour le pyrogallol et V,, = 168,72 (U.E/min.ml ), K1 =0,40 MM et K = 269,83mM pour le catéchol. La vitesse initiale d'oxydation du pyrogallol dépend de la concentrationd'enzyme. De même, l'activité de l'enzyme augmente en fonction de la température entre 25et 50°C). L'énergie d'activation de la réaction d'oxydation du pyrogallol est de 22 0/mol.L'étude de la stabilité thermique montre que la PPO est une enzyme qui n'est pasthermostable. Son activité diminue lorsqu'elle est incubée pendant 30 min aux températuressupérieures à 35°C.L'effet de la nature du solvant du milieu réactionnel sur la cinétique d'oxydation ducatéchol par la PPO a été étudié. Il a été observé que l'enzyme peut fonctionner dans desmilieux organiques et que son activité enzymatique en milieu organique est nettementinférieure par rapport aux milieux aqueux. La présence de 14% d'eau dans le milieuréactionnel suffit pour activer l'enzyme à 50%.L'inhibition de la PPO a été étudiée avec des inhibiteurs comme l'acide benzoïque,l'azide de sodium, la L-cystéine et le fluorure de sodium. Une inhibition de type compétitive a- été obtenue avec l'acide benzoïque et l'azide de sodium. Une inhibition de type mixte a étéobtenue avec la L-cystéine et le fluorure de sodium. L'acide benzoïque et la L-cystéine sontles inhibiteurs les plus efficaces.Le dosage des composés phénoliques par la PPO faite par un système à fibre optique(DEL470 ) réalisé dans notre laboratoire c'est avéré plus sensible et reproductible dans lagamme des concentrations du catéchol étudiées par rapport à la mesure traditionnelle parspectrophotométrie (UV/Vis) à 470 nm et dans les mêmes conditions. L'étude comparativeentre notre système optique et celui spectrophotomètre Jenway 6405 (UV/Visible), montreque les valeurs obtenues sont très rapprochées.Mots clés : Champignon de Paris, Agaricus hisporus, Polyphéno! oxydase, Isolation,caractérisation, biocapteur, fibre optique, DEL, Phototransistor, composés phénoliques.IIIABSTRACTIn this study the polyphenol oxidase (PPO; E.C: 1.14.18.1), was firstly extracted inaqueous mediums from acetone powder of the mushroom (Agaricus bisporus).The crudeextract of enzyme is then partially purified trough acetone and (NIH) 2SO4 precipitation. Weobserved that the différent enzyme extracts crude and partially purified exhibit both activitycatecholase and cresolase measured spectrophotometrically at 420 and 475 nm usinapyrogallol and L-tyrosine as substrate respectively. At the final step of the purification, 2-foldpurification was achieved for the two activities. The deshydrogenase enzymatic activity was189,3 and 3,35 U.E/ml for the hydroxylase activity (30°C, pH 7 phosphate buffer 0,1 M). Theextracts of the enzymes were relatively stable when they are stored at -15°C during 44 days.A much lower laccase activity was observed who represents only 0,22% of the total activitypolyphenol oxydase.The effects of the pH, temperature, substrate specificity, concentration of the substrateand enzyme, were investigated. Two optimal pH values for the various extracts of enzymeswere found, one is 5,3 and the other is 7 for both crud extract and partially purified enzymewith ammonium suiphate at 60 % or 7,6 for the enzyme extract purified with accorte withpyrogallol as substrate and it is remarkable that the enzymatic activity is maximum near theneutrality. it also proved that the optimal pH of the enzyme depends on the purity of theenzyme and the phenolic substrate used. The PPO can catalyse the mono-, di- and triphenolswith a preference of the substrate. According tO Vmax/Kni, the catechol was the best substratefollowed hy pyrogallol. The kinetic parameters of the enzyme crude extract where found atpH 7 and 25°C are : = 78,6 (U.E/min.ml ), K. = 1,4 mM and K5 = 249,82 MM forpyrogallol and Vmax = 168,72 (U.E/min.ml ), Km = 0,40 mM and K 5 = 269,83 mM for thecatechol. The initial rate of the pyrogallol oxidation was affected by the concentration ofenzyme. In the same way, the activity of the enzyme increases with the increase of thetemperature between 25 and 50°C. The activation energie (Ea) for the pyrogallol enzymaticoxidat ion was 22 kJ/mol.The study of the thermal stability shows that the PPO is flot a very heat stable enzymeand that its activity decreases when it is incubated during 30 min at the temperatures higherthan 35°C.The effect of the nature of solvent of the reactional medium on the kinetics oxidationof the catechol by the PPO was studied. It was observed that the enzyme can function inorganic mediums and that its activity in organic medium is significantly lower than in anaqueous medium. The presence of water at 14 1/o in the reaction medium was sufficient foractivate the enzyme at 50%.The inhibition ofPPO was studied with inhibitors such as benzoic acid, sodium azide,L-cysteine and fluoride sodium. A competitive-type was obtained with the benzoic acid and- . sodium azide. A mixed-type was obtained with the L-cysteine and fluoride of sodium.Benzoic acid and the L-cysteine are the most effective inhibitors for mushroom PPO.The monitoring of the phenolic compounds with the PPO made by an optical fibresystem (LED470 ) realized in our laboratory, it was shown more sensitive and reproduciblein the range of the studied concentrations of the càtechol than that the traditional measurementby spectrophotometry (UV/Vis) at 470 nm and under the same conditions. The comparative- study between our optical system and that spectrophotometer Jenway 6405 (UV/Visible),shows that the values obtained are very brought doser.Keywords: Mushroom, Agaricus bisporus, Polyphenol oxydase, extraction, characterization,biosensor, optical fibre, DEL. Phototransistor, phenolic compounds.