Comparison of the DNA Extraction Methods for Polymerase Chain Reaction Amplification from Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissues

الموضوعات

علوم تطبيقية وتكنولوجية

الملخص

A large portion of tissues stored worldwide for diagnostic purposes is formalin-fixed and paraffin embedded tissue (FFPET). These FFPE-archived tissues are an extremely valuable source for retrospective (genetic) studies. These include mutation screening in cancer-critical genes as well as pathogens detection.The goal of the current study was to evaluate the optimal method of DNA extraction from FFPET by comparing three different extraction method with and without proteinase K digestion and evaluated the impact of these DNA extraction methods in DNA quality, quantity, and amplification by polymerase chain reaction (PCR).In this study, the comparison was between three methods from five identically processed FFPET. The extraction methods, including DNA extraction kit, phenol: chloroform: isoamyl alcohol method with and without proteinase K were tested. Amplifiable DNA fragment size was assessed by amplification of exon 7 gene CYP1A1, and the size of the fragment was (312 bp).The present study shows the quantity of DNA that extracted by phenol: chloroform: isoamyl alcohol without proteinase K had higher quantity (62.63±49.93) when compared with the quantity of DNA that extract by DNA extraction kit (8.37±3.20) and method with proteinase K (14.96±7.87).In respect with DNA quality (A260/280), DNA that extracted by kit had a higher mean (1.91±0.06) with significant increasing (P≤0.05) compared to the quality of DNA that extract by using phenol: chloroform: isoamyl alcohol method with proteinase K (1.44±0.1) and without proteinase K (1.8±0.04).Also quality (A260/230) of DNA that extract by I DNA extraction kit had high significant increasing (P≤0.05) in DNA quality(2.10±0.08)compared with quality of DNA that extract by both other methods using phenol:chloroform:isoamyl alcohol with proteinase K (1.25±0.18) and without proteinase K (1.90±0.25). In addition, the quality of DNA extracted by method without proteinase K revealed significant increasing (P≤0.05) when compared to quality of DNA extracted by method with proteinase K.The results of amplification shows presence of (87%) specific band for samples that extracted by phenol:chloroform:isoamyl alcohol method without proteinase Kand (50%) specific band for samples that extracted by the same method with proteinase K.Also, the results of amplification shows presence of (62%) specific band for DNA extracted by use DNA extraction Kit.In conclusion, amplification of DNA by PCR appeared highly influenced by the extraction method used. Proteinase K pre-treatment was not a prerequisite for extractions of DNA from FFPET. The suitable extraction method was extraction kit and phenol: chloroform: isoamyl alcohol method without proteinase K but the last was more suitable as it was less time, with less cost, yielded a good DNA quantity and quality

روابط وملفات

التعريف والنوع

رقم الوثيقة

03cd62be-5a62-4793-837e-93744736497a

رقم العقد

0

نوع الوسائط

Crawler

نوع المحتوى

الرسائل العلمية

صيغة المصدر

رسائل ماجيستير

نوع الملف

pdf text

أسماء الملفات

997659_1.pdf

بيانات النشر

ترجمة العنوان

مقارنة طرائق استخلاص الدنا لتفاعل تضخيم البلمرة المتسلسل من الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمطمورة بالبرافين

ألقاب المؤلفين

[{"name_ar":"اقبال حربي كاظم","title_ar":"اعداد","title_en":"Preparation"},{"name_ar":"ميساء عادل هادي حسون","title_ar":"اشراف","title_en":"Supervision"}]

اللغة

English

المصدر والدورية

اسم المصدر

Comparison of the DNA Extraction Methods for Polymerase Chain Reaction Amplification from Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissues

المحتوى والصفحات

عدد الصفحات

0

ترجمة الملخص

إن جزءًا كبيرًا من الأنسجة المحفوظة على مستوى العالم لأغراض التشخيص هي أنسجة مثبتة بالفورمالين والمطمورة بالبارافين. ويعد أرشيف هذه الأنسجة مصدرًا قيمًا لدراسات الوراثة. تمثل هذه الدراسات أهمية كبيرة في الكشف عن الطفرات في الأنسجة الحساسة للسرطان، فضلًا عن تشخيص الأمراض. إن هدف هذه الدراسة الحالية هو استعمال الطريقة الأمثل لاستخلاص DNA من الأنسجة بالفورمالين والمطمورة بالبارافين من خلال مقارنة ثلاث طرق استخلاص مختلفة مع أو بدون الهضم بواسطة الإنزيم بروتين K، وتقويم تأثير هذه الطرق على نوعية وكمية DNA المستخلص من الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمطمورة بالبارافين وعلى ناتج تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). كانت المقارنة في هذه الدراسة بين ثلاث طرق لاستخلاص DNA من خمسة أنسجة مثبتة بالفورمالين ومطمورة بالبارافين ومعاملة بثلاث طرق المعاملات. تم اختيار طرق الاستخلاص التالية: طريقة الفينول: كلوروفورم: إيزوميا الكحول. نفس الطريقة مع استخدام الإنزيم بروتين K. طريقة بديلة تعتمد على الإنزيم بروتين K فقط. تم تقييم جزء DNA المضخم بواسطة تضخيم الأكسون 7 لجين •تر، وكان حجم القطعة (onزوج قاعي). أظهرت الدراسة الحالية أن كمية DNA المستخلص بواسطة طريقة الفينول: كلوروفورم: إيزوميا الكحول (14.96 ± 7.87 نانوجرام) ازدادت زيادة معنوية (P<0.05) مقارنة بالكمية المستخلصة بواسطة الاستخلاص بدون الإنزيم. كما أظهرت كمية DNA المستخلص بالطريقة نفسها مع الإنزيم بروتين K أعلى كمية (499.93 ± 62.63 نانوجرام) مقارنة بالطرق الأخرى. فيما يتعلق بطريقة الإنزيم بروتين K، فقد تم الحصول على كمية DNA مستخلصة (426 ± 280 نانوجرام) بزيادة معنوية (P<0.05) مقارنة بالكمية المستخلصة باستخدام طريقة الفينول: كلوروفورم: إيزوميا الكحول بدون الإنزيم (1.99 ± 0.061 نانوجرام). كما أظهرت النتائج زيادة معنوية (2.10 ± 0.08 نانوجرام) مقارنة بطريقة الفينول: كلوروفورم: إيزوميا الكحول مع الإنزيم. فضلاً عن ذلك، تم تقييم نوعية DNA المستخلص باستخدام كل طريقة، وأظهرت الدراسة أن استخدام الإنزيم بروتين K يحسن بشكل ملحوظ من نوعية DNA المستخلص مقارنة بالطرق الأخرى.

كلمات الباحثين

DNA, Formalin-fixed tissues, Paraffin-embedded tissues, Protein K, Extraction methods, PCR amplification, DNA quality and quantity

إشراف وإعداد

الإشراف

ميساء عادل هادي حسون

الإعداد

اقبال حربي كاظم

الاقتباسات الببليوغرافية